Cálculo de concentración de metabolitos mediante absorbancia: fundamentos y aplicaciones

El cálculo de concentración de metabolitos mediante absorbancia es una técnica esencial en bioquímica analítica. Permite cuantificar compuestos en soluciones basándose en la interacción luz-materia.

Este artículo detalla las fórmulas, tablas de valores comunes y ejemplos prácticos para dominar esta metodología con precisión y rigor científico.

Calculadora con inteligencia artificial (IA) para Cálculo de concentración de metabolitos mediante absorbancia

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Calcular concentración de glucosa en plasma con absorbancia a 540 nm y coeficiente de extinción molar conocido.
Determinar concentración de ácido láctico en muestra biológica usando absorbancia y longitud de camino óptico.
Obtener concentración de NADH en solución a partir de absorbancia medida a 340 nm.
Evaluar concentración de metabolito X con absorbancia 0.75, coeficiente de extinción 12000 M^-1cm^-1 y celda de 1 cm.

Tablas de valores comunes para el cálculo de concentración de metabolitos mediante absorbancia

Para facilitar el cálculo de concentración, es fundamental conocer los coeficientes de extinción molar (ε) y longitudes de onda (λ) más utilizados para metabolitos comunes. A continuación, se presenta una tabla con valores estándar ampliamente aceptados en la literatura científica.

Metabolito	Longitud de onda (nm)	Coeficiente de extinción molar ε (M^-1cm^-1)	Rango típico de concentración (μM)	Fuente / Referencia
Glucosa (reacción con DNS)	540	18100	10 – 1000	Miller, 1959
Ácido láctico (enzimático)	340	6220 (NADH)	5 – 500	Bergmeyer, 1974
NADH	340	6220	1 – 200	Bergmeyer, 1974
Ácido úrico	293	12000	10 – 300	Tietz, 1986
Colesterol (enzimático)	500	12000	50 – 500	Allain, 1974
Proteínas (Bradford)	595	— (relativo)	1 – 1000 μg/mL	Bradford, 1976
Ácido ascórbico	265	14000	5 – 200	Green, 1963

Fórmulas para el cálculo de concentración de metabolitos mediante absorbancia

El cálculo de concentración a partir de absorbancia se basa en la ley de Beer-Lambert, que relaciona la absorbancia con la concentración y otras variables físicas y químicas.

Ley de Beer-Lambert

La fórmula fundamental es:

Absorbancia (A) = ε × c × l

donde:

A: Absorbancia (adimensional, sin unidades)
ε: Coeficiente de extinción molar (M^-1cm^-1)
c: Concentración del metabolito (M, moles por litro)
l: Longitud del camino óptico o ancho de la cubeta (cm)

Para despejar la concentración:

c = A / (ε × l)

Explicación detallada de cada variable

Absorbancia (A): Es la medida de la cantidad de luz absorbida por la muestra. Se mide con un espectrofotómetro y es un valor adimensional. Valores típicos oscilan entre 0 y 2 para mantener linealidad.
Coeficiente de extinción molar (ε): Representa la capacidad del metabolito para absorber luz a una longitud de onda específica. Depende del compuesto y la longitud de onda. Valores comunes varían desde 1000 hasta 20000 M^-1cm^-1.
Concentración (c): Es la cantidad de metabolito en la solución, expresada en moles por litro (M). Puede convertirse a unidades más prácticas como μM o mg/mL según el peso molecular.
Longitud del camino óptico (l): Es la distancia que recorre la luz a través de la muestra, generalmente la anchura de la cubeta. Comúnmente es 1 cm, aunque existen cubetas de 0.1 cm o 5 cm para diferentes rangos de concentración.

Otras fórmulas complementarias

En algunos casos, es necesario convertir unidades o ajustar la concentración a unidades prácticas:

Conversión de concentración molar a mg/mL:

c (mg/mL) = c (M) × PM (g/mol) × 1000

donde PM es el peso molecular del metabolito.

Corrección por dilución: Si la muestra fue diluida antes de la medición:

coriginal = cmedida × Factor de dilución

Absorbancia corregida por blanco: Para eliminar interferencias del solvente o reactivos:

A = Amuestra – Ablanco

Ejemplos prácticos de cálculo de concentración de metabolitos mediante absorbancia

Ejemplo 1: Determinación de glucosa en plasma mediante método colorimétrico

Se mide la absorbancia de una muestra de plasma tratada con reactivo DNS a 540 nm. La absorbancia obtenida es 0.725. El coeficiente de extinción molar para el complejo coloreado es 18100 M^-1cm^-1. La cubeta utilizada tiene una longitud de 1 cm. Se desea calcular la concentración de glucosa en la muestra.

Datos:

A = 0.725
ε = 18100 M^-1cm^-1
l = 1 cm

Cálculo:

c = A / (ε × l) = 0.725 / (18100 × 1) = 4.005 × 10-5 M

Convertimos a μM:

4.005 × 10-5 M = 40.05 μM

Si se requiere en mg/dL, considerando peso molecular de glucosa 180.16 g/mol:

c (mg/mL) = 4.005 × 10-5 × 180.16 × 1000 = 7.21 mg/L = 0.721 mg/dL

Este valor puede compararse con rangos clínicos para evaluar el estado glucémico.

Ejemplo 2: Cuantificación de ácido láctico en cultivo celular

Se analiza una muestra de medio de cultivo para determinar ácido láctico mediante la medición de absorbancia a 340 nm, donde se detecta la formación de NADH. La absorbancia medida es 0.310, la cubeta es de 1 cm y el coeficiente de extinción molar de NADH es 6220 M^-1cm^-1. La muestra fue diluida 1:5 antes de la medición.

Datos:

A = 0.310
ε = 6220 M^-1cm^-1
l = 1 cm
Factor de dilución = 5

Cálculo:

cmedida = A / (ε × l) = 0.310 / (6220 × 1) = 4.98 × 10-5 M

Con la corrección por dilución:

coriginal = 4.98 × 10-5 × 5 = 2.49 × 10-4 M = 249 μM

Este valor indica la concentración real de ácido láctico en el medio, útil para monitorear metabolismo celular.

Consideraciones técnicas y normativas para el cálculo de concentración mediante absorbancia

Para garantizar resultados confiables y reproducibles, es indispensable seguir normativas y buenas prácticas en la medición espectrofotométrica:

Calibración del espectrofotómetro: Realizar calibraciones periódicas con estándares certificados para asegurar precisión en absorbancia.
Uso de blancos adecuados: El blanco debe contener todos los reactivos excepto el metabolito para corregir absorbancia de fondo.
Rango lineal: Mantener absorbancias entre 0.1 y 1.0 para evitar desviaciones no lineales de la ley de Beer-Lambert.
Temperatura y pH: Controlar condiciones para evitar cambios en coeficientes de extinción o degradación del metabolito.
Normativas internacionales: Seguir guías como las de la International Organization for Standardization (ISO 17025) para laboratorios de análisis químico.

Optimización y recomendaciones para mejorar la precisión en el cálculo de concentración

Para optimizar la determinación de concentración mediante absorbancia, se recomienda:

Utilizar cubetas con longitud de camino óptico adecuada para la concentración esperada.
Realizar mediciones en duplicado o triplicado para obtener valores promedio y reducir errores.
Preparar curvas de calibración con estándares conocidos para validar la linealidad y exactitud del método.
Evitar interferencias espectrales mediante selección cuidadosa de la longitud de onda.
Implementar controles de calidad internos y externos para monitorear la consistencia del análisis.